Китайские исследователи представили систему SmartPE для преодоления узких мест геномного редактирования двудольных культур

ПЕКИН — Генетики растений в Китае разработали оптимизированную платформу редактирования генов, предназначенную для преодоления давних ограничений эффективности у широколиственных культур, представив систему под названием SmartPE, которая повышает точность и эффективность генетических модификаций у таких видов, как томаты, соя и рапс. Инновация нацелена на прайм-редактирование — передовую производную технологии CRISPR, позволяющую исследователям вставлять, удалять и заменять определенные генетические последовательности без образования двунитевых разрывов ДНК и без необходимости использования внешних донорских матриц.

Хотя в последние годы прайм-редактирование продемонстрировало высокую практичность на модельных организмах и ключевых злаковых культурах, его применение на двудольных растениях столкнулось со структурными препятствиями. Низкая базовая эффективность редактирования у широколиственных растений часто делала технологию слишком трудоемкой или непредсказуемой для коммерческих селекционных процессов. Усовершенствовав механизмы доставки и выполнения этих правок, команда разработчиков SmartPE стремится уравнять основные овощные, зернобобовые и масличные культуры с базовыми зерновыми, которые исторически легче поддавались инструментам генной инженерии.

## Key facts

- Система SmartPE была разработана исследователями в Китае специально для повышения эффективности прайм-редактирования у двудольных (широколиственных) растений. - Платформа была протестирована на коммерчески значимых сельскохозяйственных видах, включая томаты, сою и рапс (канолу). - Прайм-редактирование позволяет исследователям осуществлять целевые инсерции, делеции и все 12 возможных типов межнуклеотидных замен без образования двунитевых разрывов ДНК. - Широколиственные культуры исторически демонстрировали низкую частоту редактирования при стандартных архитектурах прайм-редактирования, что часто требовало масштабного скрининга культур тканей для выявления успешных правок. - Исследование решает серьезную технологическую проблему, замедлявшую нетрансгенную прецизионную селекцию мировых белковых и масличных культур.

## What happened

Как сообщает phys.org, ученые-аграрии в Китае разработали архитектуру SmartPE для преодоления устойчивой неэффективности, сдерживавшей прайм-редактирование у двудольных видов. При стандартном прайм-редактировании растений молекулярный аппарат часто страдает от низкого уровня экспрессии, неоптимальной динамики обратной транскрипции или быстрой деградации гидовых РНК в клеточной среде растений. SmartPE модифицирует эти функциональные компоненты для стабилизации редактирующего комплекса и улучшения его взаимодействия с геномными мишенями растений.

В ходе проверочных испытаний исследовательская группа развернула систему на нескольких различных моделях растений и продовольственных культурах. Тесты были сосредоточены на культурах высокой экономической значимости, прежде всего на томатах, сое и рапсе. У этих растений традиционные прайм-редакторы часто показывают однозначные или близкие к нулю процентные показатели успешного редактирования в целевых участках, вынуждая селекционеров регенерировать тысячи образцов тканей для получения одной желаемой линии растений.

Путем корректировки регуляторных последовательностей, управляющих редактором, и доработки основной кассеты прайм-редактирования система SmartPE продемонстрировала заметное повышение выхода целевых мутаций у исследованных видов. Исследователи применили инструмент для внесения определенных изменений последовательности, подтвердив, что улучшенная платформа сохраняет характерную для прайм-редактирования точность, значительно повышая при этом долю успешно отредактированных клеток. Система эффективно функционировала на нескольких целевых локусах этих культур, доказав, что улучшение не ограничивается отдельным благоприятным геномным сайтом.

## Why it matters

Современное сельское хозяйство сталкивается с одновременным давлением со стороны климатической нестабильности, меняющейся активности вредителей и растущего мирового спроса на растительные белки и растительные масла. Двудольные культуры обеспечивают большую часть мирового растительного белка за счет бобовых, таких как соя, важнейшие кулинарные масла и биотопливо за счет капустных, таких как рапс, а также незаменимые микроэлементы за счет базовых овощных культур, таких как томаты. Ускорение темпов адаптации этих видов селекционерами жизненно важно для стабилизации сельскохозяйственного производства.

До сих пор прецизионная селекция этих культур в значительной степени опиралась на стандартный CRISPR-Cas9 или редакторы оснований. Традиционный CRISPR-Cas9 работает преимущественно за счет расщепления обеих цепей спирали ДНК, запуская грубые пути клеточной репарации, которые обычно приводят к случайным инсерциям или делециям. Будучи эффективным для нокаута нежелательных генов, он не может легко переписывать специфические последовательности для создания улучшенных аллелей. Редакторы оснований, представленные в 2016 году, позволяют осуществлять прямые однонуклеотидные замены, однако они биохимически ограничены: они способны превращать лишь определенные нуклеотиды в другие (например, цитозин в тимин или аденин в гуанин) и часто приводят к попутным мутациям, если в окне редактирования оказываются непреднамеренные целевые основания.

Прайм-редактирование решает обе проблемы, действуя подобно молекулярному текстовому редактору, способному находить геномный адрес и впечатывать точные замены различной длины. Однако, поскольку его применимость у двудольных была сильно ограничена низкой эффективностью выхода, агрономические компании и академические лаборатории часто отводили прайм-редактированию роль инструмента для однодольных злаков, таких как рис и кукуруза. Делая прайм-редактирование коммерчески жизнеспособным для двудольных, SmartPE открывает возможности для создания нетрансгенных культур с оптимизированными сроками цветения, повышенной засухоустойчивостью, индивидуально подобранным составом семенного масла и встроенной устойчивостью к патогенам без сохранения чужеродных бактериальных генов в геноме растений.

## The background

Траектория молекулярной селекции растений трансформировалась в 2012 году после характеристики бактериального иммунного механизма CRISPR-Cas9 в качестве программируемого инструмента редактирования генома. В течение пяти лет лаборатории по всему миру начали применять нуклеазы Cas9 для редактирования сельскохозяйственных животных, клеточных линий человека и сортов сельскохозяйственных культур. Тем не менее зависимость классического CRISPR от двунитевых разрывов создавала фундаментальные риски, включая нецелевые хромосомные перестройки и клеточную токсичность.

В октябре 2019 года исследовательская группа под руководством David Liu из Broad Institute of MIT and Harvard представила прайм-редактирование. Исходная система объединяла модифицированную никазу Cas9, которая разрезает только одну цепь двойной спирали ДНК, с модифицированным ферментом обратной транскриптазы. Конструкция направляется гидовой РНК для прайм-редактирования (pegRNA) — удлиненной молекулой РНК, которая не только распознает целевую геномную последовательность, но и несет матричную последовательность, задающую желаемую правку. После того как никаза делает одноцепочечный разрез, обратная транскриптаза считывает матрицу pegRNA и напрямую вписывает исправленный генетический код в ДНК.

Ученые-растениеводы быстро попытались адаптировать оптимизированные для человека редакторы Liu для нужд сельского хозяйства. Самые ранние прайм-редакторы растений, о которых в 2020 году сообщили учреждения, включая Chinese Academy of Sciences, достаточно хорошо работали на рисе и пшенице. Однодольные обладают клеточной средой, динамикой промоторов и характеристиками регенерации тканей, которые обеспечивали скромные, но функциональные показатели частоты прайм-редактирования, обычно составляющие от 5% до 20%.

Двудольные, однако, оказались значительно менее восприимчивыми. Широколиственные виды обладают иной архитектурой хроматина, вариативными предпочтениями кодонов и другими эндогенными ферментами репарации ДНК. Когда ранние прайм-редакторы растений применялись к таким видам, как *Arabidopsis thaliana*, табак, томат и соя, эффективность редактирования регулярно оставалась ниже 2%, а зачастую и ниже 0,1%. Хотя специализированные модификации — такие как оптимизация температуры плавления, структурированные РНК-мотивы и конфигурации с двумя pegRNA — постепенно повышали производительность в лабораторных условиях, надежная и универсально эффективная система для двудольных культур оставалась для генетиков недостижимой целью.

## Reaction

Ожидается, что разработка SmartPE вызовет значительный интерес в государственном и коммерческом секторах сельскохозяйственной биотехнологии, особенно среди научно-исследовательских институтов, ориентированных на устойчивость сельскохозяйственных культур и семеноводство.

Академические генетики растений долгое время утверждали, что дисбаланс между инструментами редактирования однодольных и двудольных смещал фундаментальные исследования растений в сторону моделей зерновых злаков в ущерб биологии зернобобовых и садовых культур. Появление специализированного инструмента для двудольных дает университетским кафедрам и международным агрономическим консорциумам, таким как Consultative Group on International Agricultural Research (CGIAR), рабочий протокол для функциональной геномики сложных широколиственных видов.

Коммерческие разработчики семян в Северной Америке, Южной Америке и Восточной Азии также внимательно следят за техническими усовершенствованиями прайм-редактирования. В отличие от генетически модифицированных организмов (ГМО) ранних поколений, включавших чужеродные последовательности ДНК бактерий или вирусов, культуры, созданные с помощью прайм-редактирования, часто подпадают под регуляторные категории, освобождающие их от дорогостоящего надзора за трансгенными объектами. Регулирующие органы в таких юрисдикциях, как Соединенные Штаты (в рамках правила SECURE от Department of Agriculture) и Китай (согласно руководящим принципам, выпущенным Ministry of Agriculture and Rural Affairs в 2022 году), создали упрощенные процедуры оценки для отредактированных культур, не содержащих чужеродных генетических вставок. Более эффективная платформа редактирования снижает затраты и время, необходимые для создания родительских линий коммерческого уровня в рамках этих модернизированных регуляторных систем.

## What we don't know yet

Хотя первоначальная демонстрация SmartPE подтверждает повышенную эффективность на тканях томата, сои и рапса, несколько критических научных и коммерческих параметров остаются непроверенными в открытом доступе. Доступные сообщения не раскрывают точных количественных показателей эффективности, достигнутых системой, в связи с чем остается неясным, достигла ли средняя частота редактирования двузначных процентов для всех протестированных культур или же она сохраняется лишь на отдельных, легкодоступных генах-мишенях.

Кроме того, долговременная точность SmartPE требует независимой проверки. Прайм-редактирование в целом характеризуется низкой нецелевой активностью, однако системы с высокой экспрессией могут непреднамеренно вызывать неспецифические правки или непреднамеренные вставки фрагментов матриц обратной транскрипции в целевом сайте. Данные с подробным описанием профиля нецелевых мутаций по результатам полногеномного секвенирования линий, обработанных SmartPE, пока не прошли тщательного сравнения с существующими эталонами.

Крайне важно, что практическая селекция растений требует, чтобы генетические правки были стабильными, наследуемыми и свободными от самого механизма редактирования. Текущие публикации не уточняют, измерялась ли заявленная эффективность в анализах на транзиентных протопластах (изолированных клетках без клеточной стенки) или на стабильно регенерированных, фертильных растениях поколений T1 и T2, передающих отредактированный признак при традиционном семенном размножении.

## What to watch

Главным ориентиром для отслеживания станет публикация рецензируемых данных с подробной молекулярной характеристикой SmartPE, включая детальные карты плазмид, таблицы оптимизации кодонов и точные значения частоты мутаций в различных хромосомных контекстах. Независимые академические лаборатории попытаются воспроизвести полученные результаты на других сложных двудольных культурах, таких как картофель, хлопок и древесные плодовые культуры.

Наблюдателям также следует отслеживать заявки на полевые испытания, подаваемые в национальные органы биобезопасности. Если разработчики или корпоративные партнеры перейдут к внедрению этих лабораторных правок в практические агрономические признаки, заявки на интродукцию в окружающую среду появятся в публичных реестрах регулирующих органов, в частности в Китае. Регуляторные документы покажут, каким конкретно признакам команда отдала приоритет, таким как устойчивость к стеблевой гнили сои, устойчивость стручков рапса к растрескиванию или продление срока хранения томатов.

Наконец, режим интеллектуальной собственности в отношении SmartPE повлияет на его глобальное развертывание. Поскольку основополагающие патенты на прайм-редактирование сосредоточены у таких институтов, как Broad Institute, Harvard University, и коммерческих спин-оффов вроде Prime Medicine, то, насколько SmartPE представляет собой отдельную патентоспособную архитектуру или опирается на существующие соглашения о перекрестном лицензировании, определит, насколько легко западные агробизнесы смогут внедрить эту платформу.

Этот материал основан на оригинальном репортаже phys.org.